2022年8月25日，復(fù)旦大學(xué)鄒欣/郝潔團(tuán)隊(duì)和上海交通大學(xué)胡曉勇團(tuán)隊(duì)在Frontiers in immunology (IF=8.8) 在線發(fā)表了題為：“An immunotherapy response prediction model derived from proliferative CD4+ T cells and antigen-presenting monocytes in ccRCC”的研究論文。該研究使用團(tuán)隊(duì)前期研發(fā)的scCODE單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析新算法(Briefings in Bioinformatics, 2022)，通過整合挖掘腎透明細(xì)胞癌單細(xì)胞和bulk RNA-seq數(shù)據(jù)，構(gòu)建了基于bulk RNA-seq數(shù)據(jù)的免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療療效預(yù)測(cè)模型，AUC達(dá)到93%。

一、研究背景

透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌(ccRCC)是最常見的腎癌組織學(xué)亞型，占所有腎細(xì)胞癌(RCC)的70%以上。大量腫瘤轉(zhuǎn)錄組分析顯示，ccRCC被免疫細(xì)胞高度浸潤，尤其是T細(xì)胞浸潤，其浸潤程度在癌癥基因組圖譜(TCGA)的腫瘤類型中是最高的。基于這一特點(diǎn)，免疫檢查點(diǎn)阻斷(ICB)療法顯著改善了晚期ccRCC患者中應(yīng)答者的治療效果。然而，很大一部分ccRCC患者對(duì)這種療法沒有反應(yīng)。這種對(duì)ICB反應(yīng)的差異性突出了識(shí)別預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物的必要性。之前對(duì)腫瘤的全外顯子組測(cè)序(WES)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序確定了與ICB結(jié)果相關(guān)的一些因素，但與其他對(duì)免疫療法具有良好反應(yīng)性的腫瘤相比，ccRCC有其獨(dú)特之處，例如，CD8+ T細(xì)胞浸潤、腫瘤突變負(fù)荷、移碼插入和缺失以及HLA雜合性在其他腫瘤類型中具有促應(yīng)答效應(yīng)，然而它們均未被證明與ccRCC的ICB響應(yīng)相關(guān)。迄今為止，推動(dòng)ICB耐藥性的因素仍然未知。臨床實(shí)踐中預(yù)測(cè)腎細(xì)胞癌ICB反應(yīng)的有效生物標(biāo)志物依舊缺乏。

二、文章摘要

為了探索在ccRCC背景下對(duì)ICB結(jié)局具有良好預(yù)測(cè)性能的免疫細(xì)胞亞型及其特征，該研究重新分析了兩個(gè)接受ICB治療的ccRCC單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)數(shù)據(jù)集。作者鑒定出了增殖型CD4+ T細(xì)胞亞型、增殖型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞型以及抗原呈遞單核細(xì)胞亞型，它們與ICB結(jié)局相關(guān)并具有良好的預(yù)測(cè)性能。這些發(fā)現(xiàn)在數(shù)個(gè)獨(dú)立的ICB治療前ccRCC bulk RNA-seq數(shù)據(jù)集中得到證實(shí)。通過整合這三種免疫細(xì)胞亞型的marker基因，作者開發(fā)了一個(gè)預(yù)測(cè)模型，該模型在CheckMate隊(duì)列(172個(gè)樣本)中的AUC高達(dá)93%。該ICB反應(yīng)預(yù)測(cè)模型有望作為一種有價(jià)值的臨床決策工具，用于指導(dǎo)ccRCC患者的ICB治療。

三、研究思路

本文的整體研究思路如圖1所示。首先，作者使用scCODE對(duì)各細(xì)胞類型進(jìn)行差異表達(dá)分析并使用MSigDB進(jìn)行GSEA分析，從scRNA-seq中鑒定了3種與ICB結(jié)局相關(guān)的細(xì)胞類型(CD4T, Treg, Monocyte)。隨后，作者對(duì)上述3種細(xì)胞類型進(jìn)行亞型分析并對(duì)差異表達(dá)基因表達(dá)定位，鑒定出3種細(xì)胞亞型(MKI67+ CD4T, MKI67+ Treg, Antigen-presenting monocyte)，GSEA和IPA分析顯示這3種細(xì)胞亞型與ICB結(jié)局密切關(guān)聯(lián)。然后，作者運(yùn)用多種方法在多個(gè)bulk RNA-seq數(shù)據(jù)集和獨(dú)立scRNA-seq數(shù)據(jù)集中重復(fù)一致地驗(yàn)證了這3種細(xì)胞亞型與ICB結(jié)局的關(guān)聯(lián)。接下來，作者使用這3種細(xì)胞亞型的marker基因，通過機(jī)器學(xué)習(xí)算法，篩選出由47個(gè)基因組成的ICB響應(yīng)預(yù)測(cè)模型——ccRCC.Sig;最后，作者使用6個(gè)bulk RNA-seq數(shù)據(jù)集和4種不同的機(jī)器學(xué)習(xí)算法對(duì)ccRCC.Sig的預(yù)測(cè)性能進(jìn)行了驗(yàn)證，并將ccRCC.Sig與9個(gè)臨床或分子特征和13個(gè)之前發(fā)表的ICB響應(yīng)簽名進(jìn)行了對(duì)比分析。

圖1 標(biāo)志物篩選，模型構(gòu)建和驗(yàn)證技術(shù)路線圖

四、研究結(jié)果

1、CD4+ T、Treg 和單核細(xì)胞與 ccRCC 患者的ICB 結(jié)局相關(guān)聯(lián)

作者重新分析了兩個(gè)scRNA-seq數(shù)據(jù)集。首先，作者從Bi’s dataset和Au’s dataset中共提取出13種細(xì)胞類型;然后使用scCODE依次識(shí)別這13種細(xì)胞類型中應(yīng)答者(R)和非應(yīng)答者(NR)的差異表達(dá)(DE)基因，共獲得了26個(gè)差異表達(dá)基因列表(DE lists);隨后每一個(gè)DE list均分別在MSigDB網(wǎng)站上計(jì)算與GOBP, Hallmark, KEGG, Reactome交疊的基因集，共獲得1008個(gè)基因集;最后分別用這1008個(gè)基因集預(yù)測(cè)CheckMate cohort(R=39, NR=133)的ICB結(jié)局，ROC曲線p值可反應(yīng)這些基因集對(duì)ICB結(jié)局預(yù)測(cè)的有效性。通過對(duì)這1008個(gè)基因集的p值分析，按照預(yù)先設(shè)定的篩選標(biāo)準(zhǔn)，作者發(fā)現(xiàn)Au’s dataset中非應(yīng)答者的CD4T(Au’s_CD4T.NR)和Treg(Au’s_Treg.NR)以及Bi’s dataset中應(yīng)答者的monocyte(Bi’s_Mono.R)的DE list所交疊的GOBP基因集對(duì)ICB結(jié)局具有顯著的預(yù)測(cè)性能。作者推測(cè)CD4T、Treg和單核細(xì)胞的某些亞型可能與ICB響應(yīng)相關(guān)。

2、MKI67+ CD4T和MKI67+ Tregs在非應(yīng)答者中豐富

作者進(jìn)一步對(duì)CD4T和Treg細(xì)胞進(jìn)行亞型分析，共獲得5個(gè)CD4T亞型和4個(gè)Treg亞型(圖2A, 2D)。通過GSVA分別對(duì)Au’s_CD4T.NR和Au’s_Treg.NR中具有有效預(yù)測(cè)性能的基因集(p.adjust這兩種細(xì)胞亞型均顯著富集促癌/促ICB抵抗相關(guān)通路，相反，抗癌/促ICB應(yīng)答相關(guān)通路則顯著被抑制(圖2H)，作者利用 IPA分析進(jìn)一步驗(yàn)證了上述GSEA分析的結(jié)果。

圖2 擴(kuò)增型CD4 T細(xì)胞對(duì)免疫治療效果有決定性影響。

3、在獨(dú)立數(shù)據(jù)集中驗(yàn)證MKI67+CD4T和MKI67+Treg

GSEA和GSVA顯示，MKI67+CD4T.Sig在CD4T_C4和CheckMate Cohort的非應(yīng)答者中均顯著富集和高表達(dá)(圖3B, 3C)。生存分析顯示，治療前較低的GSVA評(píng)分與CheckMate Cohort(n=181)的OS(圖3D, p=0.022)和PFS(圖3E, p=0.022)以及Javelin101 Cohort(n=726，OS數(shù)據(jù)不可用)的PFS(p;同樣，治療后較低的GSVA評(píng)分也與CM009_POST Cohort(n=55)的OS(p=0.018)和PFS(p=0.0093)改善顯著相關(guān)。最后作者通過單因素邏輯回歸發(fā)現(xiàn)MKI67+CD4T.Sig能夠有效預(yù)測(cè)CheckMate Cohort 中患者的ICB結(jié)局(p=0.008)。隨后作者用同樣的方法對(duì)MKI67+ Treg進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果相似。

圖3 獨(dú)立的bulk RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證增殖型CD4 T細(xì)胞對(duì)免疫治療的影響。

由于MKI67+ CD4Ts 和 MKI67+ Tregs均來自Au’s dataset，因此作者使用獨(dú)立的scRNA-seq數(shù)據(jù)集Bi’s dataset進(jìn)一步驗(yàn)證了MKI67+ CD4Ts和MKI67+ Tregs特征的普遍性。結(jié)果顯示MKI67+ CD4Ts和MKI67+ Tregs特征在非應(yīng)答者中的表達(dá)水平顯著更高。

4、抗原呈遞單核細(xì)胞與促ICB應(yīng)答有關(guān)

同樣，作者對(duì)monocyte進(jìn)行亞型分析，共獲得4個(gè)monocyte亞型(圖4A)。GSVA顯示Bi’s_Mono.R中具有有效預(yù)測(cè)性能的5個(gè)基因集(圖S2e, p.adjust治療前較高水平的GSVA評(píng)分與PFS改善顯著相關(guān)(圖4I， p=0.042)，但與OS無顯著相關(guān)性。同樣，治療后較高水平的GSVA評(píng)分與CM009_POST Cohort中患者PFS改善顯著相關(guān)(p=0.004)。此外，作者發(fā)現(xiàn)在Bi’s dataset中，與未接受ICB治療的腫瘤相比，ICB治療后腫瘤中抗原呈遞單核細(xì)胞特征顯著更高，這一發(fā)現(xiàn)在治療前后的配對(duì)樣本(CM009_Paired Cohort)中被進(jìn)一步證實(shí)。這些結(jié)果均可說明ICB治療驅(qū)動(dòng)抗原呈遞單核細(xì)胞特征系統(tǒng)性升高，應(yīng)答者與非應(yīng)答者相比，該細(xì)胞特征進(jìn)一步升高;并且ICB治療前后該細(xì)胞的富集可預(yù)示患者ICB治療獲益及其顯著延長的PFS。

圖4 抗原遞呈monocyte細(xì)胞對(duì)免疫治療效果有決定性影響。

5、ICB響應(yīng)預(yù)測(cè)模型構(gòu)建與驗(yàn)證

作者開發(fā)了由47個(gè)基因組成的ICB響應(yīng)預(yù)測(cè)模型——ccRCC.Sig，該預(yù)測(cè)模型同時(shí)富含MKI67+ CD4T, MKI67+ Treg和抗原呈遞單核細(xì)胞特征基因。對(duì)于CheckMate Cohort(R=39, NR=133)來說，ccRCC.Sig的預(yù)測(cè)AUC高達(dá)0.93。

接下來，作者通過多種方法和多個(gè)獨(dú)立bulk RNA-seq數(shù)據(jù)集對(duì)ccRCC.Sig的預(yù)測(cè)性能進(jìn)行驗(yàn)證。首先，作者使用ccRCC.Sig分別預(yù)測(cè)5個(gè)bulk RNA-seq數(shù)據(jù)集的ICB結(jié)局，AUC為0.87-1。其次，在6個(gè)bulk RNA-seq 數(shù)據(jù)集中，作者將 ccRCC.Sig 的預(yù)測(cè)性能與 13 個(gè)已發(fā)表的ICB響應(yīng)簽名(圖5E)和9個(gè)臨床和分子特征(圖5F)進(jìn)行了比較，這些結(jié)果表明ccRCC.Sig具備最佳的預(yù)測(cè)性能。隨后，作者使用4種機(jī)器學(xué)習(xí)算法對(duì)ccRCC.Sig的預(yù)測(cè)性能進(jìn)行驗(yàn)證，大多數(shù)都達(dá)到了極高的AUC(>0.9，圖5G)，這說明ccRCC.Sig具有良好的穩(wěn)定性。然后，作者對(duì)ccRCC.Sig進(jìn)行了單因素和多因素Cox回歸分析，結(jié)果表明，ccRCC.Sig與預(yù)后不良顯著相關(guān)(圖5H)，并可作為ICB治療的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。最后，作者發(fā)現(xiàn)ccRCC.sig與已知的ICB響應(yīng)分子特征顯著相關(guān)，如與免疫檢查點(diǎn)分子(PD-1、CTLA4、IDO1)、促ICB抵抗的髓系浸潤特征呈正相關(guān)，與促ICB應(yīng)答的血管生成信號(hào)呈負(fù)相關(guān)。

圖5 ccRCC免疫治療療效預(yù)測(cè)模型構(gòu)建。

該研究不僅為ccRCC免疫治療提供了一個(gè)有效的預(yù)測(cè)模型，也為各種預(yù)測(cè)模型的開發(fā)提供了一個(gè)可選流程，該方法可適用于各種腫瘤治療的預(yù)測(cè)模型的開發(fā)。

論文的通訊作者為復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院郝潔研究員，復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院鄒欣副研究員和上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院胡曉勇主任醫(yī)師。上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院2021級(jí)碩士鄭坤為論文第一作者。

該研究得到了國家自然科學(xué)基金(82170045，31800253)，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院高水平地方高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì) (SSMU-ZLCX20180502)的支持。