基于微流控混合芯片制備核酸脂質納米顆粒(mRNA-LNP合成為例)實驗操作指南及LNP合成質量檢測、轉染細胞實驗方案.

目錄

實驗方案：微流控混合方式制備包裹mRNA的脂質納米顆粒

1. 配制復方脂質-乙醇溶液：

2. 配制檸檬酸緩沖液

3. 計算RNA濃度，配制 mRNA-檸檬酸緩沖液：

4. 微流控混合(智能LNP合成儀S1的操作說明)：

5. 粒徑和PDI的檢測

6. 產(chǎn)物的處理和保存

實驗方案：使用Qubit測定LNP包封率及利用率

實驗方案：使用酶標儀測定LNP包封率

實驗方案：mRNA-LNP轉染293T細胞

實驗方案：微流控混合方式制備包裹mRNA的脂質納米顆粒(mRNA-LNP的制備)實驗目的：

參照 Moderna、BioNtech 和 Alnylam 的新冠疫苗配方，以SM102、ALC-0315、MC3為主要陽離子脂質制備包載 mRNA 的脂質納米顆粒(lipid nanoparticles, LNPs)。

實驗原理：

ALC-0315、 MC3、和 SM102 是三種可用于人體的脂質。在酸性條件下，質子化形成陽離子脂質，能夠通過靜電作用和帶負電的 mRNA 結合。脂質與溶有mRNA的水性溶液混合后析出，自組裝形成載有 mRNA 的脂質納米顆粒。本實驗中采用微流控混合法，讓脂質溶液與mRNA溶液在微混合器中充分、迅速、高度可重復地形成粒徑均一可控的LNP。在制備過程中，脂質溶解于乙醇，核酸溶解于酸性緩沖液中，故制備得到的LNP初產(chǎn)物含有高濃度乙醇。因此后續(xù)還需要透析或者超濾去除殘余的乙醇并將溶液體系置換至中性緩沖液中，以備后續(xù)生物學實驗及長期保存。

實驗所需微流控設備及芯片：

設備：FluidicLab 智能LNP合成儀(型號：LNP-S1)(微流控LNP合成)

微混合芯片：FluidicLab LNP-B1

實驗步驟：

1. 配制復方脂質-乙醇溶液

2. 配制檸檬酸緩沖液

3. 計算RNA濃度，配制 mRNA-檸檬酸緩沖液

4. 微流控混合(智能LNP合成儀S1的操作說明)

5. 粒徑和PDI的檢測(良好的LNP合成結果如圖)

6. 產(chǎn)物的處理和保存

6.1.透析

6.2.超濾

實驗步驟詳細內容較長，可瀏覽器搜索FluidicLab前往官網(wǎng)查看完整實驗方案。

附件：

LNP合成超濾與不同條件透析對比

實驗條件：儀器：Fluidiclab-S1 ;芯片：Fluidiclab-B1

MC3配方：12 mM濃度;流速比(脂相：水相)= 1 : 3;前廢液 0.2 mL; LNP空包無mRNA;

合成初始——初產(chǎn)物經(jīng)檸檬酸緩沖液稀釋5倍后檢測;

超濾使用Millipore 15mL/30 kd 超濾離心管(外徑50mL尺寸)[UFC903096]。

透析使用Thermo Scientific™ Slide-A-Lyzer 透析盒 (20K MWCO)[66003]。

超濾后濃縮則使用[66003]透析盒后再使用[UFC903096]進行濃縮。

實驗步驟參照第一節(jié)：《實驗方案：微流控混合方式制備包裹mRNA的脂質納米顆粒(mRNA-LNP的制備)》。

mRNA-LNP轉染HEK-293T

FluidicLab 提供LNP的DLS檢測，包封檢測，細胞轉染等方案，歡迎咨詢。