【導讀】

肺癌是最常見、造成死亡最多的癌癥，其中非小細胞肺癌(NSCLC)是肺癌中最高發(fā)的亞型。由于腫瘤的高轉(zhuǎn)移能力，盡管實施了新的靶向治療和化療方案，但NSCLC 患者的死亡率仍然過高。癌癥相關(guān)的成纖維細胞(CAFs)是腫瘤間質(zhì)的主要組成部分，它是致癌、增殖和侵襲的主要原因，并且在促進癌癥進展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。CAFs與腫瘤細胞之間的接觸已被證明可以通過激活抗凋亡途徑或誘導上皮細胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)來促進腫瘤細胞的增殖。因此，靶向CAFs可能對治療癌癥有價值。

吡非尼酮(以艾思瑞為主要代表藥物，下文簡稱PFD)是一種吡啶類化合物，具有抗纖維化、抗炎、抗氧化的作用。有報道稱吡非尼酮可以抑制CAFs的細胞活力和膠原生成，抑制CAFs在乳腺癌中誘導腫瘤生長，也有報道顯示吡非尼酮使腫瘤微環(huán)境正�；�。然而吡非尼酮對NSCLC抑制機制的數(shù)據(jù)還不是很多。

【研究進展】

來自日本大阪大學醫(yī)學院的專家團隊，進行了一項旨在進一步分析吡非尼酮在NSCLC腫瘤微環(huán)境中的作用的研究，評估PFD對正常成纖維細胞的特性，以及肺正常成纖維細胞(LNFs)和CAFs的臨床樣本的影響。該論文已發(fā)表在《SCIENTIFIC REPORTS》上。

【研究結(jié)果】

研究團隊使用了來自不同組織類型的細胞，其中1型來自腺鱗癌，2型來自腺癌，3型來自鱗狀細胞癌。

結(jié)果一：吡非尼酮抑制LNFs和CAFs的激活水平和細胞因子的產(chǎn)生。

如上圖所示，在顯微鏡下，來自3個NSCLC組織的所有細胞均顯示為典型的紡錘狀成纖維細胞，與PFD共同處理后，無論是在CAFs還是在LNFs中，細胞生長均被抑制。

此外，如上圖所示，PFD組的ACTA2、膠原蛋白我和IL-6水平也有所下降。

雖然透明質(zhì)酸合成酶2(ha-2)的mRNA水平在CAFs中并不比在LNFs中高，但與PFD共處理后，其表達受到了強烈的抑制，LNFs和CAFs的平均降幅分別為0.07和0.08。Western blot分析顯示了與RT-PCR相同的趨勢。

在接下來檢測PFD對細胞因子產(chǎn)生的抑制作用的試驗中，ELISA檢測結(jié)果顯示，IL-6的濃度在CAFs中高于LNFs(1.64倍)，而TGF-β1的濃度幾乎相等，僅高于LNFs(1.09倍)。吡非尼酮抑制IL-6和TGF-β1細胞因子的產(chǎn)生，對IL-6的抑制作用更大，平均降低0.65，而TGF-β的降低率為0.10。

結(jié)果二：CAFs和LNFs對NSCLC細胞的EMT狀態(tài)有很強的影響，而吡非尼酮除了對成纖維細胞或NSCLC細胞有直接作用外，還能抑制腫瘤-基質(zhì)相互作用。

為探究PFD對NSCLC細胞與CAFs或LNFs相互作用的影響，研究團隊將A549和NCI-H358細胞與CAFs或LNFs共同培養(yǎng)。為了確定PFD對這些細胞相互作用的影響，而不是對細胞本身的影響，在培養(yǎng)24小時后去除PFD。

結(jié)果顯示CAFs或LNFs處理后，A549細胞的形態(tài)顯著改變?yōu)榧怃J、不規(guī)則的形態(tài)，細胞與細胞的接觸作用減弱，而PFD預處理CAFs或LNFs對這些變化表現(xiàn)出顯著的抑制作用。

通過免疫熒光檢測粘附蛋白E-cadherin的表達來評估A549細胞的粘附特性，結(jié)果如下圖所示：

在CM與CAFs或LNFs的細胞接觸時，E-cadherin的表達降低，在CAFs -CM處理的細胞中降低作用更明顯，PFD預處理可恢復兩種細胞系中E-cadherin的表達。纖維連接蛋白的表達水平隨著CM的改變而升高，PFD對LNFs或CAFs的CM均有抑制作用。

用CM、CAFs或LNFs培養(yǎng)NSCLC細胞，觀察其侵襲和遷移能力。結(jié)果如下圖所示：

與未處理細胞相比，CM處理CAFs或LNFs顯著增強了A549細胞的侵襲能力，其中CAFs -CM比lnf處理細胞的侵襲能力增強更明顯 (圖2C)。

相反，PFD預處理降低了A549細胞的侵襲。CAF或LNF CM處理A549細胞遷移也分別增加了2.60和2.70。

而PFD預處理CAFs或LNFs則抑制了A549細胞遷移(圖D)。在創(chuàng)面愈合實驗中也得到了類似的結(jié)果(圖E)。

此外，與來自未處理細胞的CM相比，PFD預處理CAFs的CM可以減弱A549細胞的遷移，表明PFD預處理CAFs的CM可以減弱A549細胞的遷移。

如上圖所示，A549-CM延長了a-SMA高表達CAFs的形態(tài)，而PFD預處理降低了CAFs的變化。

此外，A549細胞在CM處理后增強了CAFs的遷移和侵襲能力，而這些能力被PFD預處理A549所抑制。

結(jié)果三：人體內(nèi)CAFs促進腫瘤進展，而吡非尼酮通過抑制腫瘤-間質(zhì)串擾抑制腫瘤進展。

研究團隊將帶有CAFs的A549或NCI-H358細胞按2:1的比例移植到裸鼠背部右側(cè)，未帶CAFs的細胞移植到裸鼠背部左側(cè)皮下，以檢測PFD對體內(nèi)腫瘤進展的影響。

植入后2周，開始每日給藥PFD，持續(xù)3周。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CAF共植入組腫瘤生長更明顯，而PFD顯著抑制A549細胞的腫瘤生長，NCI-H358細胞的腫瘤生長差異不明顯。

在兩種細胞類型中，PFD在NSCLC單獨組中也顯示出腫瘤生長抑制趨勢。免疫組織學分析顯示，共植入組E-cadherin的表達低于對照組(A549細胞中E-cadherin的表達為0.27倍，NCI-H358細胞中E-cadherin的表達為0.37倍)。

但經(jīng)PFD處理后，恢復與對照組相比，共植入組a-SMA表達呈彌漫性增厚，經(jīng)PFD處理后，無論是在共植入組還是單獨NSCLC組，a-SMA表達均呈稀疏狀。

結(jié)果四：吡非尼酮治療人類IPF患者的過程中，還改善了人體組織中的腫瘤標記物的水平。

研究團隊研究團隊對接受PFD治療的IPF患者的腫瘤標記物進行評估，包括E-cadherin、a-SMA和Ki67。作為對照，也對未進行PFD治療的腫瘤標本進行了評估。兩組患者大多數(shù)為鱗狀細胞癌。

雖然E-cadherin的表達幾乎相同，但在接受PFD治療的患者腫瘤中，α- SMA陽性程度和Ki67標記指數(shù)均有所降低。

【研究結(jié)論】

上述研究在細胞水平和動物水平上，證明了吡非尼酮可以抑制促腫瘤生長因子的的產(chǎn)生，抑制腫瘤-基質(zhì)相互作用;在人體組織水平，證明了吡非尼酮可以改善腫瘤標記物的水平。

因此，吡非尼酮(以艾思瑞為主要代表藥物)可能有很大的潛力作為一種新的NSCLC治療藥物。吡非尼酮治療NSCLC的前瞻性臨床試驗值得期待。

【參考文獻】

Fujiwara A, Funaki S, et, al. Effects of pirfenidone targeting the tumor microenvironment and tumor-stroma interaction as a novel treatment for non-small cell lung cancer. Sci Rep.